2025

液相反相色谱柱活化与维护方法

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一、反相色谱柱活化

1 先不接色谱柱，仪器系统冲洗干净，并替换至100%纯甲醇或者纯乙腈（选甲醇还是乙腈，建议和实验流动相中有机相保持一致）

2 接上色谱柱，100%甲醇或乙腈冲洗20倍柱体积。

3-1 若该色谱柱实验流动相中水相不含盐，直接用流动相平衡20柱体积。

3-2 若该色谱柱实验流动相中水相含盐，先用等比例不含盐的流动相冲洗20柱体积，再用流动相冲洗20柱体积。

3-3 若是梯度洗脱程序，冲洗比例是初始流动相比例。

4 最终到压力基线平稳，若不平稳可延长平衡时间。

举例1：比如您的实验流动相是：甲醇/磷酸盐溶液，比例：50:50。C18柱子规格：250mm 4.6mm，该柱子单倍柱体积2.5mL，20倍柱体积是50mL。如果流速是1mL/min，则每一步冲洗50min。

具体操作：建议仪器先不接柱子接两通，将仪器冲洗干净并替换至纯甲醇，之后接上色谱柱，分别按照甲醇—甲醇水（50:50）—甲醇/磷酸盐（实际流动相）溶液的顺序平衡。每一步平衡20柱体积。

举例2：比如您的实验流动相是：甲醇/磷酸盐溶液，梯度洗脱，流动相初始比例：10（甲醇）:90（磷酸盐）。C18柱子规格：250mm×4.6mm，该柱子单倍柱体积2.5ml，20倍柱体积是50ml。如果流速是1mL/min，则每一步冲洗50min。

具体操作：建议仪器先不接柱子接两通，将仪器冲洗干净并替换至纯甲醇，之后接上色谱柱，分别按照甲醇—甲醇水（10:90）—甲醇/磷酸盐（10:90）溶液的顺序平衡。每一步平衡20柱体积。

色谱柱一般流速推荐：4.6mm内径柱子，柱流速：1mL/min左右；3.0mm内径柱子，柱流速：0.5mL/min左右；2.1mm内径柱子，柱流速：0.2mL/min左右。（注意：不要超过色谱柱最高耐受压力）

二、反相色谱柱维护

如发生压力升高，柱效下降（柱压正常，柱效下降的客户，可以从第二条看起）：

1. 首先判断除色谱柱外仪器压力是否正常，从柱温箱卸下液相柱，原本接液相柱的位置换成液相两通，走纯水流动相，流速1mL/min，首先判断仪器压力是否正常（一般仪器不会超过30bar，1290二代仪器一般不超过50bar）。

2. 若使用保护柱，应先排除是否保护柱的问题，可以先去掉或更换新的保护柱，检查压力和柱效的情况。

若仪器除色谱柱外压力正常，去掉保护柱后仍存在压力高、柱效下降等问题时，首先断开柱子和检测器的连接，用以下步骤冲洗色谱柱：

90%纯水/10%有机相（甲醇或乙腈，分析流速冲洗）—50%纯水/50%有机相（分析流速冲洗）—纯有机相（甲醇/乙腈，分析流速冲洗，如果柱效恢复，则无需下一步冲洗。常规冲洗，也就到此步为止）—纯异丙醇（异丙醇粘度较大，建议冲洗流速为分析流速五分之一，避免超压）

每一步冲洗的目的：高水相冲洗残留的缓冲盐，避免后面冲洗有机相导致盐析—过渡—纯有机相冲洗反相保留较强的污染物—洗脱能力更强的流动相冲洗。注意：每个步骤原则上冲洗10-20倍柱体积，可以根据实际情况适当的增加或者减少。

对于压力上涨幅度较大或者柱效下降幅度较大（比如50%以上）的问题，且色谱柱粒径大于1.8um或1.9um粒径的色谱柱，建议直接进行反冲处理，冲洗步骤相同。

举例：以4.6*250*5um规格的Plus/XDB/SB-C18色谱柱为例，操作如下：

1.90%水10%乙腈，流速1mL/min，冲洗体积：25mL （如果流动相或者样品中水溶性成分或者盐含量过高，可以适当延长冲洗时间）

2.50%水50%乙腈，流速1mL/min，冲洗体积：25mL （过渡）

3.100%乙腈，流速1ml/min，50mL （如果样品或者污染物中反相保留的化合物含量过高，可以适当延长冲洗时间）

4.100%异丙醇，0.3ml/min，50mL （以上两步冲洗效果不佳的情况下，尝试异丙醇冲洗）

冲洗完毕后，用25mL乙腈（先低流速0.3mL/min冲洗，看压力平稳后，也就是异丙醇被逐渐替换除去，再适当的增加流速到1mL/min，需要注意压力不要骤然升高）。替换出异丙醇溶液，接上检测器，再用流动相平衡色谱柱，进标样测试峰型。注意：带异丙醇冲洗时，流速需要降低，防止压力过高。必要时，流速可以再降低，但需要保证冲洗体积。

如果效果依旧不佳，可以尝试色谱柱反冲，冲洗的方法和正向冲洗一致。另外，反冲色谱柱或者正冲较脏的色谱柱时，色谱柱后端不接检测器，流出的流动相直接进废液，以免污染检测器。